高分辨率质谱成像技术在植物次生代谢物组织空间分布研究中的应用
代谢组学作为系统生物学的重要分支，近年来在植物研究领域得到越来越多的关注，并广泛应用于植物抗逆性、发育可塑性、基因功能、代谢调控网络等研究领域。与此同时，一项新的研究技术——质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）应运而生，在生命科学领域得到了广泛关注和应用，成为了与传统光学显微成像互为补充的“分子成像显微镜”。
质谱成像是一种原位表面分子成像技术。该技术利用离子源直接扫描生物组织样本而完成组织表面待测物的可视化分析，并借助质谱的结构鉴定能力，获取化合物的分子结构信息。图1所示为采用高空间分辨率TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像系统对植物的种子、根、茎、叶片以及穗轴等进行了可视化检测，研究植物生长发育过程中代谢物的空间分布特征。
图1. 应用TransMIT AP-SMALDI 10质谱成像系统可以实现植物不同组织/器官中代谢物特异性空间分布的可视化分析，空间分辨率在5-20μm。
1. 油菜种子发育过程中代谢物组织分布及变化研究
种子的萌发和成熟是发育过程中代谢高度活跃的两个阶段，与植株的生长发育状况和种子的营养品质息息相关。本研究对萌发阶段和成熟的油菜种子进行了对比分析，发现亚精胺缀合物与胚轴胚根的发育有关。如图2所示，在种子萌发过程中，环亚精胺缀合物（[M+H]+, m/z 496.24421，图2d，红色）从种子的胚轴胚根区转移到了正在萌发的幼根（图2c，红色），三咖啡酰亚精胺（[M+K]+, m/z 534.20009，图2e、2f，红色）也表现出了同样的趋势。由此可以看出，高分辨质谱成像技术能够精准定位化合物的特异性空间分布，明确植物不同发育阶段代谢物在组织中的动态变化，为揭示植物的生长发育提供了强有力的可视化研究工具。
图2. 早期萌发（a）和成熟（b）油菜种子的横切面光学成像图以及不同代谢物的组织特异性空间分布质谱成像图（c-f，多代谢物质谱成像叠加图）。
2. 小麦穗轴中代谢物的组织特异性空间分布研究
穗轴是禾本科作物小穗、小花和种子的载体，也是连接“源和库”的桥梁。根系吸收的水分和矿物质、叶片的光合产物以及茎鞘储藏物质的再转运与再分配均需通过穗轴进入籽粒。以往研究表明，穗轴还能够有效抵御病原菌的侵染，保护作物的产量和品质不受侵害，但是其防御机制目前尚不明确。如图3所示，本研究对小麦穗轴横切面进行了质谱成像检测，结果表明一种多酚糖苷类物质（[M+H]+, m/z 565.15518，图3b，绿色）主要分布在表皮，另外两种代谢物溶血磷脂酰胆碱（LPC，图3b，蓝色）和脱镁叶绿素（图3b，红色）主要分布在薄壁组织细胞中。其中溶血磷脂酰胆碱可以通过参与合成真jun肽、防御性信号分子等物质起到防御病原菌侵染的作用。
图3. 小麦穗轴横切面UV光学图像（a）和质谱成像叠加图（b）。
3. 小麦茎基部次生代谢物的空间分布研究
小麦茎基部是连接根系和地上部的主要部位，也是养分运输和物质再分配的主要通道。由于茎基部接近地表，且地表相对地上部分通风条件差，温湿度相对较高，极易受到土传病原菌的侵害。本研究以小麦茎基部为例，对其内部化合物的组成和空间分布进行了质谱成像分析，结果显示一种多酚糖苷类物质（[M+K]+, m/z 565.15518，图4b，红色）特异性地分布于叶鞘中，而磷脂酰胆碱分子（[PC(36:4)+K]+, m/z 820.52531，图4b，绿色）主要分布在茎中。与LPC类似，PC分子也能够通过参与kan病信号分子茉莉酸等的合成来防御病原菌侵害。因此，在植株受到病原菌侵染后，采用质谱成像技术能够鉴定病变组织中代谢物的变化及空间分布，有助于植物kan病机理的深入研究。
图4. 小麦茎基部横切面光学图像（a）和质谱成像叠加图（b）。
4. 水稻根中代谢物的空间分布研究
根是植物的营养器官，负责吸收土壤中的水分及无机盐，并具有固着、繁殖、贮存合成有机物质的作用。如图5b所示，本研究精确定位了己糖和磷脂酰胆碱在水稻根系中的特异性组织分布，其中多聚己糖（[M+K]+, m/z 867.23784，图5b，红色）特异性分布于根皮层中，而PC分子（[PC(36:4)+K]+, m/z 820.52531，图5b，绿色）则主要分布在表皮和除木质部导管外的中柱部位。因此，可视化分析碳水化合物的组织特异性空间分布可为植物不同器官之间化合物的转运及源-库关系研究提供准确可靠的科学依据。
图5. 水稻根部横切面光学图像（a）和质谱成像叠加图（b）。
5. 禾谷镰刀菌侵染后小麦种子中外源性和内源性代谢物的空间分布研究
禾谷镰刀菌（F. graminearum, Fg）是导致禾谷类作物严重减产和品质恶化（籽粒干瘪皱缩）的主要zhen菌病原体，且积累在种子中的zhen菌毒素对人体和动物有害。如图6所示，本研究分别对健康小麦种子（图6a）和Fg侵染的种子（图6b）进行了对比分析，质谱成像结果显示多聚己糖（[M+K]+, m/z 705.18502，图6c、6f，红色）均匀的分布在二者的胚乳部位，而病原菌相关的代谢物4-(trimethylammonio)but-2-enoate（[M+K]+, m/z 182.05779，图6f，绿色）则特征性地分布在病害种子的麸皮部位。因此，可以通过质谱成像技术寻找与病原菌侵染机制相关的代谢物开启人们对植物防御机制的新认识。
图6. 健康小麦种子光学图像（a，b）；病害种子光学图像（d，e）；健康种子质谱成像图（c）；病害种子质谱成像叠加图（f）。
综上所述，本文主要以农作物为研究对象，介绍了TransMIT AP-SMALDI 10高分辨质谱成像系统在植物次生代谢产物组织特异性空间分布研究中的应用，该技术同样适用于其它植物如中cao药、蔬菜、果树、花卉等研究对象，为科研工作者提供更为直观的分子成像方法，为各领域科研人员带来全新的研究视角。
说明：本文图片均来源于Analyst, 2015, 140, 7696-7709, DOI: 10.1039/C5AN01065A
